1.分子标记与MAS育种

随着时代的发展，越来越多的在许多作物中保持重要农艺重要性的种子在育种过程中被占用或克隆，实现快速生长需要改良的种子数量从一颗增加到数颗。在利用MAS提高分娩效率的过程中，需要同时满足现代分娩要求更多的筛选种子，目前市场上有多种分子标记技术，包括测序基因分型-GBTS（Genotyping by Target Sequencing）液体芯片技术，可以通过激活靶点中心的深度来识别基因型，基于PCR的分子标记方法，为基因分析（分子标记分析）提供数学工具。

为了测量多种突变的亲本组成，还需要对多种具有全基因组遗传背景标记的基因进行检测，并选择最常见的基因突变（通常根据客户的历史背景），目前通过测序进行基因分型（Genotyping Through Sequencing，GBS）技术已成为识别分娩背景体征的重要标准。在未来的育种过程中，高通量SNP鉴定方法将成为育种鉴定基因型的重要途径，为育种发展指明方向。

1.1本文研究的主要内容

本研究的目的是开发能够检测遗传和历史预期的分子标记技术，该技术被定义为混合型，旨在同时改进育种和遗传探索的几个不同目标（预期）的组合，FBI技术一种新的经济实惠、高质量和完全集成的全基因组分子标记方法。通过对实验内容的进一步细化，确定了最佳的实验和生物数据分析程序，并使用不同的作物对其进行了鉴定，其应用范围广泛，最终开发出能够检测多种遗传倾向和所有遗传历史的新技术，共同实现多重期望符号可以扩展，可以创建数千个背景符号，可以节省大量资金，并且可以制作自产种子的标牌，具有灵活性和适应性。

1.2 FBI技术的设计原理

这一概念采用连续技术作为分子标记辅助生殖研究，跨平台测序的主要原因是桑格测序平台的数千倍，其成本逐年降低，远低于每Gb的成本。第三代测序，最高可达60元级别，大大降低了大数据背景下的育种成本，此外Ilumina 后来开发了 Hiseq和Miseq等集成系统，为饲养员提供了更多选择。该方法利用Tn5转座酶、二代测序技术和LM-PCR的高效利用，将三种不同的DNA菌株结合在一个实验中完成文库设计，FBI-seq的原理如图1-10所示。

2 材料和方法

2.1 实验材料、主要仪器

2.1.1实验材料

数据由广东省农业科学院水稻研究所新品种育种实验室提供，亲本为黄光华展2号和R4372。其中黄光华展一号具有三个主要成分：防止稻裂和影响枯萎病；质量好，达到国家三级标准；三行背线。而R4372亲本则是华占和美香占2号004的中间材料，米质优秀，粒型特长，有香味，抗稻瘟病，株型批散，两个亲本间具有很高的同源性。测试了黄光华展2号与R4372之间的46代线路连接，同时鉴定了小麦抗瘟基因Pi2、香气基因BADH2、育性恢复基因Rf3和Rf4、品质基因Waxy等5个期货，FBI-seq方法用于检查人类杂交祖细胞中的各种有效、经济且具有免疫性的新化合物。成虫共有46株植物，分别被列入FBI-1、FBI-2……FBI-46。

为了研究FBI技术是否可用于测量不同作物的分子标记，选取了5个数据作为证据，包括：辣椒品种-螺丝椒（Capsicum annuum var.longum)n091,辣椒品种-樟树港辣椒(Capsicum annuum var.fasciculatum)1101,茄子品种-绿冠(Solanum melongena var.ser-pentinum)1111, 豆角品种-长虹豆(Vigna unguiculata ssp.sesquipedalis)1121, 番茄品种-番茄1706(Solanum lycop ersicum cv.Heinz 1706)。选择所有种类的不同页面中国农业科学院深圳基因组研究所），并使用检测设备提取DNA进行FBI-seq分析。

2.1.2主要仪器及其在研究中的用途

Nanodrop2000分光光度计：美国赛默飞世尔科技公司，用于确定DNA样品和DNA文库的浓度，以及确定 DNA的质量。

琼脂糖凝胶电泳测量：确定DNA分离和PCR分析的质量。

荧光定量PCR测量：在本研究过程中，通过荧光定量的过程，利用并排基因识别目标视觉的激活，以确保种子的进展接近。

磁轴：DynaMagTM-2 Magnet (12321D)，美国赛默飞世尔科技公司。这些装置仅用于在建库过程中吸附携带核酸的磁珠，同时纯化DNA。根据Beads的数量和浓度，吸附的 DNA 爆发的长度会有所不同，0.5×的浓度可以吸附1K以上的片段，1.8×的浓度可以吸附200bp以上的片段，本实验采用1.2倍材料体积的磁珠机进行DNA纯化实验。

2.2 实验研究方法

2.2.1目标前景（特异位点）检测引物的设计

FBI方法的主要优点是可以同时检查待测作物的目标视力和遗传背景，以达到灵活的目标，八种新品种。背夹为Mismatch或从PTMA获得，前端引物的设计根据待测种子确定，以BADH2引物模型为例，如图2-1所示，首先根据数据或信息询问遗传学的基因组数据源，并使用DNAMAN或其他工具对不同类型谷物的输出序列进行比较和减去。各种变异的SNP或InDel，在多态位点附近创建约100bp的合理前景引物。未来底漆开发的另一个要求是特殊的强度和高温退火。设计引物需要在P5末端测序中加入一部分接头序列（二代测序需要两端接头，P5为5'端接头序列），为保证特殊引物能够扩增，在距引物500~1000bp处设计另一引物与前引物进行PCR组装，检查前景引物是否可以扩增。

图1引物设计

2.2.2生物信息学分析方法

从测序原始数据到最终分析结果的基本流程，如下图2-2所示：

图2 测序数据分析流程图

本研究中的等效项是Nova测序或Xten球串联连接，均使用 PE150组合端测序方法。提取旧的Read1/Read2.fastq.gz文件，即raw文件，传输到xShell操作平台进行数据分析。

先用Fastqc等软件分析数据质量，包括体积测量数据，读取数字等，然后用Trimmomatic软件对原始数据进行裁剪过滤，得到，去掉Read1开头的冲突，得到Clean Read，最终得到Read1比Read2稍大的两端clean文件。参数：LEADING:20,TRALING:20, SLIDINGWINDOW:4:15,MINLEN:21,HEADCROP:20，结果对比文件使用Samtools中的命令压缩成bam文件，产品无效。然后使用Picard工具（1.118版）中的“MarkDuplicates”模块删除副本得到去重后的bam文件，然后对其进行其他检查，如数字标签、库插入大小、调用SNP、深度信息等，引物结合位点分析等。

使用Samtools 调用整个基因组的SNP，同时将亲本测序数据与使用的基因组进行比较，通过比较植物与其亲本的SNP数据，研究植物的每个SNP的亲本位置以确定其基因型，使用SEG-map分析技术，识别每个播种机的组合功能，细分标记，以背景分布作为对照组，析种群联系，从IGV Broswer确定植物中靶基因的基因型和遗传来源的PTMA，并使用Perl和R语言进行识别检查引物的结合位置。

Linux常用软件：Fastqc、Trimmomatic、bedtools、jellyfish、bwa、samtools、picard、blastn、blastall、qualimap、seqkit、Rscript和awk操作命令等。

最常用的web和windows软件：IGV、DNAMAN、MG2C、Cluster Omega、Primer5.5、Stepone software V2.3、PS、AI、OSS Browser、WinSCP、xShell等

3总结

本研究计划的FBI技术的实验和临床试验将提供更好的理解和对未来应用程序开发的重大影响，FBI技术克服了分子标记过程成本高、工作繁琐、失败率和标记准确率高的问题，具有检测效率高、成本低、适应性广、应用灵活等特点，需要对所有育种作物的遗传和基因型进行检测，有望成为多种作物共享的工具和平台。可广泛应用于诊断设备、生物检测、基因工程、分子标记辅助选择、遗传质量监测等，确定遗传学前景和背景。总而言之，优化后的多视角FBI-seq方法将帮助优秀育种者完成新品种的测试，节省育种时间，为育种发展提供新的服务。在下一阶段的研究中，我们将继续改进方法，以确定该方法是否可以一步完成或使用简单的引物完成实验。最终期望这项技术可以达到流程更简单的目标，实现对育种研究的快速推进。

参考文献：

1.王康健;荆华;车喜庆;“十四五”新时期下盘锦市水稻育种现状及建议[J];现代农业科技;2021年17期

2.杨祥波;陈殿元;王晓航;水稻育种技术课程教学改革实践——以吉林农业科技学院为例[J];安徽农学通报;2021年14期

3.刘翠侠;水稻育种的途径与技术探析[J];农家参谋;2021年10期